Forum Entomologi Italiani

Bisogna stare attendi a diffondere leggende metropolitane ...
Qui le questioni sono addirittura tre: la conservazione di materiale per studi genetici; l'uso dell'etile acetato; l'etica dell'uccisione.

Lasciando da parte per un attimo l'etica, che ognuno si terrà ben cara la sua, e venendo alla questione delle analisi genetiche bisogna essere chiari. Se uno spende delle migliaia di euro per andare a Katmandù per raccogliere qualcosa da sottoporre ad analisi genetica fa benissimo ad utilizzare l'alcool assoluto (che però continuo a considerare uno spreco) ed a tenere i campioni in congelatore. Inutile rischiare qualsiasi accidente. Ma se uno sta conservando quintali di materiale nella futura eventualità che questo possa servire per analisi genetiche i costi di stoccaggio in alcool assoluto in congelatore sono proibitivi. Perché non dire, come è vero, che è sufficiente alcool a 95% (ed anche a 75%) conservato a temperatura ambiente? Io collaboro con colleghi che estraggono il DNA, non hanno mai avuto problemi con il nostro materiale ucciso con etile acetato e conservato in alcool al 75%. Certo il materiale deve esservi stato immerso subito dopo la morte (o l'anestesia) ed il volume dell'insetto deve essere irrisorio rispetto a quello dell'alcool. Nel caso di esemplari molto grossi vanno prese precauzioni, tipo tagliarli in due, in quattro, in otto, o cambiare l'alcool dopo 24 ore, aut similia.

Tornando all'etile acetato, non danneggia il DNA. Aspetto smentite. Certo che un insetto buttato in un vaso con sughero (o in qualche altro posto) e lasciato lì 24-48 si deteriora, ma non è l'azione dell'etile acetato. Io i Neurotteri li uccido in provette di vetro con tappo di cotone imbevuto d'etere e li passo in alcool IMMEDIATAMENTE dopo la morte apparente (che molto spesso è una semplice anestesia). Molti colleghi li buttano in alcool direttamente, ma io sono contrario (e nel mio laboratorio è proibito) per due motivi: si contraggono e diventano poco esaminabili anche in alcool, per motivi etici (e turna).

Nulla impedisce, a chi abbia un poco di coscienza "francescana", di perdere pochi secondi per anestetizzare un insetto prima di ucciderlo. Personalmente inorridisco di fronte al racconto di uccisioni con contenitori di metallo lasciati al sole. Meglio che io non sappia chi è, altrimenti perderei l'amicizia. Così come non credo siano giustificate inutili sofferenze per motivi estetici, come far morire di fame le libellule, anche lì 24 ore sono più che sufficienti per vuotare l'intestino. Il problema è che è più comodo metterle in bustina e pensarci solo una volta per la preparazione, vuoi stare a perdere tempo per ucciderle ? Così come è più comodo buttare il materiale in alcool invece di stare a perdere tempo a tirarlo fuori dal vaso dopo un'ora ... non si sa mai che così, proprio in quel minuto, si perda l'occasione di prendere qualcos'altro, magari un morpha nuovo a cui dare un epiteto "quarto" !

Ciao Roberto

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verum stabile cetera fumus

Ciao Roberto,

sono perfettamente d'accordo con te, anch' io uccido qualsiasi insetto solo ed esclusivamente con etere
acetico, a mio parere non c'e nessun altro sistema migliore di questo.
Il trucco e' di usarne pochissimo, gli insetti prima si anestetizzano e poi, povere bestie, muoiono.
Molto etere nei flaconi fa si che gli insetti non perdano la loro rigidita' post mortem, e per sempre
rimarranno duri, oppure elastici da non poter piu' essere preparati. Inoltre l'etere in grosse quantita' ha un'altra
controindicazione, cioe' scioglie i grassi dell'addome, e se i colori sono chimici li rovina. Vedi le cicindele,
oppure alcune crisomele, le meloe, ecc. Poco etere, tenere gli insetti per circa una giornata nel flacone e mai a temperature elevate, fa si' che in questo lasso di tempo loro perdono la rigidita' post mortem e siano perfetti per essere preparati. Poi io li tolgo dall'etere e li conservo in frigo per anni senza altri problemi collaterali.
Secondo me le altre sono alchimie che funzionano e non funzionano, dipende da come uno considera un esemplare rigido oppure morbido da preparare. Per me' morbido e' come vivo, pertanto dopo svariate prove ho deciso da tempo a lasciar
perdere qualsiasi intruglio chimico, ma di concentrarmi sull' uccisione dell'insetto, deve essere la piu' indolore possibile, se cosi' si puo' dire, e la successiva conservazione, che deve essere ottimale. Questo non poteva essere fatto 20/30 anni fa, ma ora un piccolo congelatore dovrebbe far parte del corredo entomologico di tutti.
Invece vedo da queste discussioni che buona parte di noi si munisce di pentole, bricchi ed alambicchi vari, fornelli e provette ecc. ecc. Ma il risultato a mio parere cambia poco, se l'insetto e' stato ucciso male, non c'e' piu' nulla da fare per rimediare, rimarra' cosi' per sempre e non ci saranno altre metodologie per farlo tornare morbido.

ciao,

Franco Sandel

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Effe Esse

Evidentemente sono stato male interpretato.


Intendevo solo dire che a me è stato chiesto di mettere direttamente gli esemplari in etanolo al 95%, e di lasciarveli, eventualmente cambiando l'alcool ogni tanto. Non mi è stato chiesto di tenerli in congelatore (quello lo faccio io per i miei insetti, ma dopo averli uccisi con l'acetato di etile). per quanto mi riguarda, uccidere gli insetti in alcool lo facevo quando avevo 11 anni e nessuno che mi dicesse come fare, ma già a 12 avevo capito che, oltre a soffrire per ore (e a volte per giorni) restavano duri e impreparabili).


Era solo un'ipotesi che facevo come possibile spiegazione del perchè mi venisse chiesto di metterli direttamente in alcool. Se poi è l'essiccamento il problema, allora basta metterli in alcool prima che secchino.




Non credo che esista questo rischio. Questo entomologo dai metodi un po' barbari non è italiano.


Certo non sono uno che si diverte a far soffrire gli insetti (o altri animali), anche se è pur vero, che comunque ne ammazziamo in quantità enormi, e non per necessità. Ma se iniziamo questo discorso va a finire che per essere coerenti dobbiamo mollare tutto e limitarci a fare foto.
Tanto per dire, quando trovo i miei insetti preferiti, ovvero gli (le) Julodis, nemmeno mi pongo il problema di come ammazzarli. Li tengo tutti vivi in contenitori singoli finchè non torno a Roma (per fortuna sono molto resistenti e un po' di giorni in un barattolino con qualche buco per l'aria e un po' di vegetali da mangiare non gli fanno un baffo) e poi li tengo in una specie di terrario con tre pareti e tetto in rete, parete frontale in vetro e fondo in plastica, con 20-25 cm di terra sabbiosa e rametti di varie piante che gli cambio ogni 1 o 2 giorni. Li preparo e li metto in collezione dopo che sono morti "di vecchiaia", in genere dopo qualche mese e dopo essersi accoppiati e, le femmine, aver deposto le uova. Ci manca solo che gli dia un nome proprio e me li porti a spasso al guinzaglio (però qualche volta me li porto a scuola!).

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Maurizio Gigli
http://utenti.romascuola.net/bups
http://bup.xoom.it/

Maurizio,
ma non penserai che io ce l'avevo con te? Ho solo preso spunto per un discorso generale. Tanto è vero che ci sono cose, come hai fatto notare, che non avevi detto .

Come tu fai con gli Julodis io faccio con i Neurotteri !

Ciao Roberto

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verum stabile cetera fumus

OK
Ciao

P.S. - Sono abituato ad essere accusato di crudeltà verso gli animali da alcuni colleghi a scuola quando scoprono che sono entomologo, e neanche sanno di che stanno parlando (per non parlare di chi mi definisce "etnologo"

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Maurizio Gigli
http://utenti.romascuola.net/bups
http://bup.xoom.it/

La mia esperienza circa la resistenza o decadimento del DNA (o mRNA) è totalmente differente. Almeno per i Lepidotteri, sono matematicamente sicuro che sequenziare (almeno) i geni COI, COII e Ef1a è possibile anche su materiale secco, vecchio fino a 4-5 anni, purchè seccato dopo la cattura e mai ri-ammolito o preparato.
Con Keith Willmott (del McGuire Center di Gainsville) stiamo portando avanti una indagine di filogenesi molecolare sui Pieridae andini (generi Catasticta, Leodonta, Pereute e Leptophobia). La procedura per il campionamento di circa 450 esemplari è stata la seguente:
1) materiale fresco: esemplare catturato sul campo, ucciso per pressione del torace, addome staccato e immesso in microprovetta per criogenia con alcool assoluto (95°)
2) materiale secco: quando l'esemplare veniva in nostro possesso (per esempio, materiale ottenuto da cacciatori locali), si staccavano 2-3 zampe e si inserivano nella microprovetta con alcool assoluto.
I campioni sono stati tutti conservati per anni in frigo (non congelatore) a 2-4°, consegnati a Keith recentemente in occasione di una sua visita a Lecce, e proprio pochi giorni fa mi ha inviato i primi risultati...
Ne deduco che il materiale genico non si era alterato più di tanto per l'essiccamento dell'esemplare, nè per la conservazione a temperature basse, ma non da congelatore. A quanto mi dice Keith, ci sono stati solo due campioni (sui primi 50) da cui non sono riusciti a estrarre nulla. Parliamo di un 4% di insuccesso, credo una percentuale accettabile.
A riprova di ciò, riporto un brano tratto da Braby, M.F., Vila, R. & Pierce, N.,E., 2006 - Molecular phylogeny and systematics of the Pieridae (Lepidoptera: Papilionoidea): higher classification and biogeography. Zoological Journal of the Linnean Society, 147: 239–275.

Specimen preparation
Specimens were collected as fresh adults from the field using a hand net and killed by pinching the thorax. Wings were immediately excised and stored in paper envelopes as vouchers for identification and the bodies were preserved in plastic vials containing 100% ethyl alcohol. The specimens were temporarily stored at −20 °C for laboratory use and then ultimately transferred to −80 °C for permanent storage. A few of the specimens were collected and preserved (from a few months to several years) as dried adults before the
wings and body were stored and preserved as for the fresh specimens.

Come si può vedere, il materiale secco è stato utilizzato quanto il materiale fresco, quando questo non era disponibile.

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Maurizio Bollino

L'acool assoluto è l'etanolo al 100%, non si ottiene per distillazione e costa un occhio. L'etanolo comune è etanolo al 95%, si ottiene per distillazione e costa un occhio della testa al comune cittadino, ma per usi scientifici costa a noi, che lo paghiamo caro rispetto ad altre parti d'Italia, 3 € litro (senza accise).

Il DNA è una bestia strana. Per esempio è inestraibile da materiale in alcool denaturato (anche se decolorato). Può invece facilmente essere estratto da materiale secco ben conservato. A volte però si estrae il DNA delle muffe. Mi hanno anche raccontato che negli insetti predatori spesso si estrae il DNA delle vittime ancora non digerite nel mesenteron (per quello si usano preferibilmente le zampe).

Comunque la sicurezza aumenta con la purezza dell'etanolo e la diminuzione della temperatura di conservazione. Si arriva ad una sicurezza accettabile, a mia esperienza, con alcool al 95% ed una conservazione a temperatura di cantina.

Ciao Roberto

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verum stabile cetera fumus

Si, certo, mi riferivo a quello a 95°, che ho pagato un bel pò avendolo acquistato da comune cittadino.



Che è esattamente quello che abbiamo fatto noi: alcool al 95% e temperatura 2-4°.

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Maurizio Bollino

Su conservazione materiale per studi genetici e estrazione di DNA ho un po' di esperienza.

1. gli insetti possono essere uccisi in etere o direttamente in alcool (dipende solo dal vostro cuore)
2. i campioni debbone essere al piu' presto trasferiti in alcool assoluto e conservati in congelatore (nei laboratori a -40 assicura una conservazione illimitata).
3. mettere pochi esemplari per contenitore e cambiare l'alcool almeno una volta dopo 24 ore.
4. per gli esemplari grandi molti chitinizzati (Cetonie) o si stacca una parte del corpo e si conserva solo quella (zampa) o e' consigliabile praticare una iniezione di alcool all'interno del corpo per fissare al piu' presto i tessuti.
5. per i Glaphyridi uso provette "vacutainer" (quelle col tappo di gomma con il vuoto dentro che si utilizzano per i prelievi di sangue) levo il tappo ci metto l'alcool con 2-4 esemplari al massimo, richiudo e poi con una siringa attraverso il tappo aspiro l'aria. Vedrete che gli insetti si gonfiano perche' l'alcool penetra immediatamente all'interno dell'insetto e fissa i tessuti. Cambio l'alcool entro 24 ore. Per i Cetoniini stacco il pronoto per assicurare il passaggio dei fluidi.

Con questo metodo per insetti chitinosi si ottiene una lavorabilita' del 100% e quando vai in posti difficili a prendere bestie mitiche vuoi essere sicuro che poi in laboratorio non devi buttare tutto.

L'estrazione del DNA da esemplari secchi e' possibile ma spesso da quelli vecchi o male conservati alla fine sequenzi solo DNA di funghi.... e allora ti mordi le mani...

CONSERVATE SOLO IN ALCOOL ASSOLUTO E TENETE IN CONGELATORE.

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Guido Sabatinelli
Museo di storia naturale, Ginevra, Svizzera
http://www.glaphyridae.com
http://www.scarabeidi.it

Gli esemplari uccisi in etere e conservati immediatamente in congelatore (in barattoli col sughero triturato) possono essere trasferiti in alcol assoluto per estrarne poi il DNA? E si, per quanto tempo si possono conservare in congelatore "non in alcol"?

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Daniele

Io ho appena imbastito un esperimento,ho preso una larva di cerambycidae morta , l'ho inserita in una provetta di quelle con il tappo in gomma assieme a chicchi di riso e alcuni granuli di quei sacchettini che si trovano nelle confezioni degli elettrodomestici, che teoricamente dovrebbero assorbire l'umidità dell'aria. L’ho poi chiusa e aspirato fuori aria con una siringa fintanto che facevo fatica a tirare lo stantuffo. A quel punto l'ho messa in congelatore. Ho pensato che la pressione negativa, se pur non spinta dovrebbe facilitare la sublimazione e i granuli "assorbenti" ridurre il livello di umidità dell'aria. Farò dei controlli periodici per vedere se funziona e vi terrò aggiornati. Secondo voi ci sono possibilità che funzioni?

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Nicola Dal Zotto

Io non metterei il gel di silice nel congelatore con gli alimentari

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Daniele

In teoria no, o meglio al costo dell'estrazione (circa 6-15$ a esemplare) lo fai solo quando sei disperato perche' col DNA non si e' mai sicuri al 100% che si sia conservato anche nelle migliori condizione o nelle peggiori.

La prassi e' di trasferire in alcool assoluto, dopo poco, gli esemplari uccisi con etere prima che si attivino gli enzimi di decomposizione e questo in funzione di vari fattori (vedi sotto). La cosa migliore e' portarsi dietri un boccettino con alcool dove trasferire gli esemplari.
Ma anche qui siccome l'alcool serve a bloccare la decomposizione bisogna che entri a contatto dei tessuti muscolari e questo e' in funzione di:
- grandezza esemplare e durezza tegumenti
- purezza alcool (mettere pochi insetti che i liquidi lo diluiscono e campbiarlo dopo poco)
- temperatura ambiente (mettere al fresco gli esemplari dopo la raccolta)

Buona raccolta! Guido

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Guido Sabatinelli
Museo di storia naturale, Ginevra, Svizzera
http://www.glaphyridae.com
http://www.scarabeidi.it

Sono nuovo nuovo per il forum e vorrei aggiungere la mia esperienza personale e s epossibile chiedere di fare il punto della discussione iniziale: riammolimento insetti.
Io fino ad oggi, ho sempre usato, per Coleoptera soltanto però, acqua e ammoniaca, nella concentrazione venduta commercialmente (che penso essere 6% ammoniaca). Sempre ottimi risultati con tutte le famiglie, specie "villose", colori, non subiscono alcuna modificazione. i tempi di idratazione variano solo per dimensione dell'esemplare: da pochi minuti per specie piccole (5-15 min) a qualche giorno per grandi. Con maggior concentrazione ammoniaca, ancora più rapido. Inoltre all'estrazione dalla concentrazione gli esemplari sono ben pulibili da incrostazioni terra o altro.
il difetto che ho sempre rilevato di questo metodo è l'odore, che comporta l'areazione del locale dove si lavora.
Volevo sapere se qualcuno di voi l'ha mai adoperato o se da evitare per qualsiasi motivo che conoscete.

Andrea,
certamente l'ammoniaca non è il massimo della salubrità come vapori da respirare. Quanto meno, è fortemente irritante per le vie respiratorie anche a basse concentrazioni, e irrita ancora di più la consorte........
Io, in questo periodo, ho fatto tutte le prove suggerite nei post precedenti, in pratica ho provato tutto o quasi il "Kamasutra dei rammollimenti" e alla fine ..... la santa, vecchia camera umida (magari, negli esemplari più grossi, aiutata da qualche iniezione di acqua tiepida nel torace) è il sistema che ho trovato più "predicibile" ed affidabile. Acqua + acido acetico, o acqua + acetone + acido acetico: con le bestie piccole (tipo Anthaxia secche da molti anni) il sistema spesso determina una eccessiva macerazione delle parti membranose, con conseguente distacco di femori, tibie, tarsi o antenne. Per le bestie + grosse (da una Cetonia in su), l'immersione deve essere prolungata (quindi, tanto vale utilizzare la camera umida). Oltretutto l'utilizzo di questi sistemi richiede una "curva di apprendimento" relativa ai tempi di immersione richiesti per i singoli esemplari (dimensioni, stato di disseccamento, modalità di uccisione, presenza o meno di colori chimici, ecc.).
La camera umida, invece, è modulabile (si verifica se la permanenza è sufficiente, altrimenti si rimanda la preparazione), predicibile (si è certi che, nel tempo adatto alle dimensioni degli esemplari da preparare, tutti o quasi saranno rammolliti al punto giusto), affidabile (difficile, a meno che non si dimentichino all'interno per giorni, che gli esemplari si rovinino, e non interferisce con le colorazioni chimiche).
Per quanto mi riguarda, quindi, continuo a preferire il sistema classico. Vecchie e nuove alchimie le lascio a chi ha voglia di provarle......

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Maurizio Bollino